Need for Speed? 100-mal schnelleres DNA-PAINT

Wissenschaftler am Max-Planck-Institut (MPI) für Biochemie ermöglichen mit optimierten DNA-Sequenzen 100-mal schnellere Multiplex-DNA-PAINT-Mikroskopie

2. Juli 2020

• DNA-PAINT verwendet DNA-basierte Sonden, um biologische Strukturen im Nanomaßstab sichtbar zu machen
• Optimierte DNA-Designs ermöglichen eine 100-mal schnellere und mehrfarbige Bildgebung
• Mikroskopie mit hohem Durchsatz und molekularer Auflösung könnte in Zukunft helfen, um zum Beispiel das Wechselspiel verschiedener Tumormarker besser zu verstehen

Speziell designte DNA Sequenzen ermöglichen eine 100-fache Beschleunigung in der DNA-PAINT-Mikroskopie. Einzelne Moleküle wie EGFR und Her2 können nun auf Zelloberflächen in Minutenschnelle sichtbar gemacht werden. Auf dem Bild wurden die Proteine (oder Tumormarker) EGFR (cyan), Her2 (magenta), ErbB3 (gelb) und c-Met (rot) abgebildet.

Mithilfe der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie können Stukturen kleiner als 200 Nanometer, also unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts, sichtbar gemacht werden werden. Eine der Mikroskopietechniken, genannt DNA-PAINT, wurde von Ralf Jungmann, Forschungsgruppenleiter am MPI für Biochemie und Professor für Experimentalphysik an der Ludwig-Maximilians-Universität München, zusammen mit Kollegen entwickelt. Die Technik verwendet kurze ‚Imager‘, farbstoffmarkierte DNA-Stränge, die vorübergehend an ihre Zielmoleküle komplementär binden, um das notwendige "Blinken" für eine superauflösende Rekonstruktion der Bilder zu erzeugen.

„Wir haben kürzlich die bisher eher langsame Aufnahmegeschwindigkeit von DNA-PAINT durch Optimierung des DNA-Sequenzdesigns um eine Größenordnung verbessert", sagt Jungmann. „Dies ging jedoch auf Kosten des Multiplexings, was bedeutet, dass mehrere Strukturen in der Zelle nicht mehr gleichzeitig beobachtet werden können.", fügt Jungmann hinzu. Mehrere Proteine gleichzeitig räumlich zu beobachten ist wichtig, um zum Beispiel komplexe Signalkaskaden zwischen Tumoren und normalen Zellen besser zu verstehen.

Multiplexing war bei der geschwindigkeitsoptimierten DNA-PAINT bisher nicht erreichbar, da nur eine optimierte Sequenz mit verbesserten Hybridisierungeseigenschaften zur Verfügung stand.  „Wir haben uns gefragt, wie wir die Multiplex-Bildgebung ermöglichen und gleichzeitig die Bildaufnahmegeschwindigkeit noch weiter erhöhen können", sagt Sebastian Strauss, Erstautor der Arbeit und Mitarbeiter in Jungmanns Gruppe.

In der aktuellen Studie stellen die Forscher ein neuartiges Konzept vor, mit der es ihnen gelungen ist die Bildaufnahmegeschwindigkeit zu verbessern. Sie machten sich die Tatsache zunutze, dass die Häufigkeit der Bindung der Imager an ihre Zielstränge linear mit der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen verläuft. „Je mehr Bindestellen es gibt, desto schneller verläuft die Aufnahme. Eine einfache Verkettung von Bindungsstellen würde jedoch zu unerwünscht langen Andocksequenzen führen, wodurch die erreichbare Bildauflösung möglicherweise reduziert und die unspezifische Bindung erhöht würde", so Strauss. Um diese Probleme zu umgehen, entwarfen die Forscher aus den bekannten Basen, Thymin (T), Cytosin (C), Adenin (A) und Guanin (G), sich wiederholende Sequenzmotive z.B. (TCC)n, die so verkettet werden könnten, dass sie überlappende Bindungsstellen bei nur minimal zunehmender Stranglänge ergeben. „Wir entwarfen sechs individuelle, regelmäßige Sequenzmotive, die es uns erlaubten, Multiplexing in geschwindigkeitsoptimiertem DNA-PAINT einzuführen", sagt Strauss. „In Kombination mit früheren Verbesserungen können wir DNA-PAINT jetzt 100-mal schneller machen", fügt Jungmann hinzu.

Von der Steckplatte zur Anwendung
Um die neuen Sequenzmotive zu optimieren und ihre Verbesserungen zu testen, verwendete die Gruppe DNA-Origami-Strukturen. Hierbei handelt es sich um selbstassemblierende DNA-Objekte in Nanometergröße, die sich autonom zu einer Art „Steckplatte“ falten. Diese Platten werden  verwendet, um DNA-PAINT-Bindungsstellen in präzisen Abständen von zum Beispiel fünf Nanometern anzuordnen. Auf diese Weise ist es den Forschern möglich, die Verbesserungen von DNA-PAINT unter definierten Bedingungen zu untersuchen. „Die neuen optimierten DNA-Sequenzen erlaubten uns sechs verschiedene DNA-Origami-Strukturen statt nur einer, in nur wenigen Minuten aufzulösen.", erklärt Strauss.

„Wir freuen uns darauf, die verbesserte Bildgebungsgeschwindigkeit in DNA-PAINT für biologische Fragestellungen anzuwenden. Bisher konnten z.B. Tumormarker nur langsam und nicht eindeutig auf Einzelmolekülebene untersucht werden. In unsere Studie bestätigen wir mit der Messung von vier verschiedenen Tumormarker eine schnelle und genaue Analyse des Orts und der Interaktion der einzelnen Moleküle. Dies könnte wichtige Erkenntnise für die Medikamentenentwicklung und deren Wirkmechanismen liefern", so Jungmann abschließend.

Originalpublikation: 
S. Strauss & R. Jungmann, Nature Methods, Juni 2020
DOI: https://doi.org/10.1038/s41592-020-0869-x

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